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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12746 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die vollständige holographische Charakterisierung (THC) wird hier als effiziente, automatisierte und markierungsfreie Methode zur genauen Identifizierung der Zelllebensfähigkeit vorgestellt. THC ist eine Einzelpartikel-Charakterisierungstechnologie, die die Größe und den Brechungsindex einzelner Partikel mithilfe der Lorenz-Mie-Theorie der Lichtstreuung bestimmt. Obwohl die Beurteilung der Zelllebensfähigkeit in vielen Anwendungen, einschließlich der Herstellung von Biologika, eine Herausforderung darstellt, beinhalten traditionelle Ansätze oft eine unzuverlässige Markierung mit Farbstoffen und/oder zeitaufwändige Methoden der manuellen Zellzählung. In dieser Arbeit haben wir die Lebensfähigkeit der Hefe Saccharomyces cerevisiae in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Isopropanol als Funktion der Zeit gemessen. Alle THC-Messungen wurden in der natürlichen Umgebung der Probe ohne Verdünnung oder Zugabe von Markierungen durchgeführt. Holographische Messungen wurden mit einem holographischen Inline-Mikroskop unter Verwendung einer 40\(\times)-Objektivlinse mit Planwellenbeleuchtung durchgeführt. Wir verglichen unsere Ergebnisse mit THC mit der manuellen Zählung lebender und toter Zellen, die mit Trypanblau-Farbstoff unterschieden wurden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass THC anhand des Brechungsindex einzelner Zellen effektiv zwischen lebenden und toten Hefezellen unterscheiden kann.

Die Verwendung von Hefezellen, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, ist sowohl in der Industrie als auch in der Wissenschaft allgegenwärtig1,2,3 für Anwendungen von zellbasierten Experimenten bis hin zur Proteinherstellung. Beispielsweise dient Hefe in der medizinischen Forschung als Modellorganismus zur Untersuchung genetischer Mutationen, die für Krebs relevant sind4,5,6. In der biopharmazeutischen Forschung und Herstellung werden Hefezellen als Minifabriken für die Produktion von Proteinen von Interesse eingesetzt7,8,9. Darüber hinaus wird Hefe in einer der bekanntesten Anwendungen in der Forschung und Herstellung von Konsumgütern eingesetzt, um die Bier-, Wein- und Brotherstellung zu optimieren10,11,12,13.

Die Lebensfähigkeit der Zellen ist in vielen dieser Anwendungen ein wichtiger Parameter14. Obwohl es zahlreiche Methoden zur Messung der Lebensfähigkeit von Hefen gibt, haben die meisten eine Einschränkung: die Notwendigkeit, Zellen mit einem Farbstoff anzufärben. Farbstoffbasierte Methoden wie der Trypanblau-Ausschlusstest (TB) basieren darauf, dass gesunde Zellmembranen für den Farbstoff undurchlässig sind, während die Membranen toter oder beschädigter Zellen die Diffusion des Farbstoffs in die Zelle ermöglichen15. Obwohl diese Methode nützlich ist, erfordert sie in der Regel eine mühsame Probenvorbereitung und manuelle Zellzählung. Die manuelle Zellzählung leidet unter niedrigen Statistiken und ist anfällig für menschliches Versagen. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass der TB-Ausschlusstest die Lebensfähigkeit überschätzt und für bestimmte Zellproben mit einer Lebensfähigkeit von weniger als 70 %–80 % unzuverlässig ist16,17,18.

Darüber hinaus besteht bei allen Lebensfähigkeitsmessungen mit farbstoffbasierter Färbung die Gefahr, dass der Farbstoff auf unbeabsichtigte Weise entweder mit den Zellen oder mit einer anderen experimentellen Variablen interagieren kann. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass Trypanblau negativ mit Zellen interagiert, diese häufig aufbricht und so Lebensfähigkeitsmessungen unzuverlässig macht19. Obwohl die Mängel markierungsbasierter Lebensfähigkeitstests bekannt sind, gibt es nur wenige markierungsfreie Alternativen20.

In dieser Arbeit stellen wir eine markierungsfreie, automatisierte Technik vor, um die Lebensfähigkeit von Hefe mithilfe der Total Holographic Characterization® (THC) zuverlässig zu messen. THC ist eine auf holographischer Videomikroskopie basierende Technologie, die entwickelt wurde, um unsichtbare Partikel in Suspension zu erkennen, zu zählen und zu charakterisieren21. Hier haben wir die Lebensfähigkeit von Hefen mithilfe von xSight bewertet, das THC implementiert und holographische Mikroskopie mit mikrofluidischer Probenhandhabung kombiniert, um präzise Messungen der Partikelgröße und des Brechungsindex zu ermöglichen. Durch die Verwendung von mikrofluidischen Einweg-Probenchips wird sichergestellt, dass es zu keiner Kreuzkontamination zwischen den Proben kommt und keine Reinigung erforderlich ist. Jede Messung ist automatisiert und dauert etwa 15 Minuten.

Holographische Bildgebung wurde in früheren Studien mit lebenden Zellen verwendet22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. In mehreren Studien wurden wichtige biophysikalische Zellparameter wie Zellvolumen, Zelldicke und Trockenmasse gemessen und verfolgt22,23,28,31,32. Die Einschränkung dieser Ansätze besteht jedoch in der Notwendigkeit eines Medienaustauschs und einer Manipulation der Medienosmolarität, um Veränderungen im Zellvolumen und Brechungsindex zu stimulieren. Die vorliegende Arbeit führt Messungen in der natürlichen Umgebung der Zellen durch, ohne dass Medienaustausche oder -modifikationen erforderlich sind. Auch bei der Messung des Brechungsindex einzelner Säugetierzellen durch quantitative Phasenbildgebung mit digitaler holographischer Mikroskopie wurden erhebliche Fortschritte erzielt31,32. In diesen Studien wurde der Brechungsindex mit der Zellgröße korreliert und zur Unterscheidung zweier menschlicher Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien verwendet. In den Studien, in denen der Brechungsindex ganzer Zellen gemessen wurde, wurde jedoch keine Korrelation mit der Lebensfähigkeit der Zellen berichtet. Diejenigen, die die Zellgesundheit mit holographischen Techniken beurteilt haben, haben dies an Säugetierzellen unter bestimmten Bedingungen getan, wie z. B. Infektionen mit P. falciparum29, Exposition gegenüber Cadmium30, Exposition gegenüber einer Vielzahl organischer Nanopartikel33 und anderen toxischen Verbindungen34,35. In dieser Arbeit messen wir den Brechungsindex ganzer Zellen von Hefe in einem einzigen Medium in ihrer natürlichen Umgebung. Wir zeigen, dass der Brechungsindex von Zellen mit THC schnell bestimmt und mit dieser neuartigen, markierungsfreien, automatisierten Technik zur genauen Beurteilung der Lebensfähigkeit verwendet werden kann.

Um THC als neue Technologie für Lebensfähigkeitsstudien zu demonstrieren, verwendeten wir Alkohol, um Hefezellen schrittweise abzutöten, wie dies in früheren Lebensfähigkeitsstudien von Hefen geschehen war36,37. Wir zeigen die Veränderungen der Lebensfähigkeit von Saccharomyces cerevisiae unter verschiedenen Konzentrationen von Isopropanol und vergleichen unsere Ergebnisse mit der Färbung mit Trypanblau.

Wir verwenden holographische Videomikroskopie21,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 um die Lebensfähigkeit von Hefen zu beurteilen. Bei unserem Ansatz fließen suspendierte Partikel (z. B. Hefezellen) durch einen Mikrofluidik-Chip, während sie von einem kollimierten Laserstrahl beleuchtet werden. Von den Partikeln gestreutes Laserlicht interferiert mit dem einfallenden Laserlicht und bildet ein Interferenzmuster, das als Hologramm bezeichnet wird. Ein Schema dieser Technologie ist in Abb. 1a dargestellt.

(a) Ein Schema der holographischen Videomikroskopie: Während Zellen durch einen Mikrofluidikchip fließen, werden sie von einem Laserstrahl beleuchtet. Von den Partikeln gestreutes Licht interferiert mit dem einfallenden Licht und bildet Hologramme, die auf einer Kamera aufgezeichnet werden. (b) Ein Streudiagramm der Größe auf der horizontalen Achse und des Brechungsindex auf der vertikalen Achse für 4 Partikelarten: Polystyrolkugeln mit einem Durchmesser von \(1,51\,\upmu\)m Durchmesser (in Cyan), \(2,56\,\upmu\) )m Durchmesser Polystyrolkugeln (in Violett), \(1,49\,\upmu\)m Durchmesser Silica-Kugeln (in Orange), \(2,63\,\upmu\)m Durchmesser Silica-Kugeln (in Gelb). Jeder Punkt im Diagramm repräsentiert ein einzelnes Partikel, das während der Messung mit THC entdeckt wurde. Die farbigen Kästchen sind benutzerdefinierte Bereiche von Interesse. Partikel außerhalb der 4 benutzerdefinierten Felder werden grau gefärbt.

Die Hologramme werden mit einer Kamera aufgezeichnet und entsprechen der Lorenz-Mie-Theorie der Lichtstreuung40,48,49,50. Eine schnelle Optimierung der Anpassung mit mehreren Parametern liefert dann verschiedene Partikelparameter, darunter Partikelgröße, Brechungsindex und die dreidimensionale Position, die diesem Hologramm entsprechen. Wir rekonstruieren nicht das dreidimensionale Bild jedes Partikels, sondern extrahieren morphologische Informationen über jedes Partikel aus der Symmetrie seines zweidimensionalen Hologramms. Ein wesentlicher Vorteil dieses auf holographischer Videomikroskopie basierenden Ansatzes besteht darin, dass THC zusätzlich zur Partikelgröße den Brechungsindex jedes Partikels quantifiziert, der Aufschluss über seine Zusammensetzung gibt. Abb. 1b zeigt beispielsweise ein Streudiagramm einer Probe, die aus einer Mischung von vier verschiedenen Partikelarten besteht: Polystyrol-Mikrokügelchen in zwei Größen und Siliciumdioxid-Mikrokügelchen in zwei Größen. Jeder Punkt im Diagramm stellt ein einzelnes Partikel dar, das xSight während der Messung erkannt hat. Auf der horizontalen Achse ist der gemessene Partikeldurchmesser und auf der vertikalen Achse der gemessene Partikelbrechungsindex aufgetragen. Die farbigen Kästchen sind benutzerdefinierte Bereiche von Interesse, die verschiedenen Partikelarten entsprechen. Die Punkte sind entsprechend der Region, in die sie fallen, farbig. Aus dem Streudiagramm lassen sich leicht vier Hauptpartikelverteilungen erkennen, zwei mit einem Brechungsindex von etwa 1,61 in Cyan und Violett und zwei mit einem Brechungsindex von etwa 1,43 in Orange und Gelb. Bei diesen Verteilungspaaren handelt es sich um Polystyrol- bzw. Silica-Mikrokügelchen. Der Brechungsindex von Polystyrol in Wasser beträgt bei Beleuchtung mit einem blauen Laser 1,61 und ein Brechungsindex von 1,43 entspricht dem von porösem Siliziumdioxid. Es ist wichtig zu beachten, dass mit einem Standard-Partikelgrößenmessgerät in dieser Probe nur zwei Populationen sichtbar wären: eine bei einem Partikeldurchmesser von etwa \(1,5\,\upmu\)m und eine bei einem Partikeldurchmesser von etwa \(2,6 \,\upmu\)m. Da THC neben der Größe auch den Brechungsindex misst, können Partikel gleicher Größe, aber unterschiedlicher Zusammensetzung leicht unterschieden werden, wie etwa \(1,49\,\upmu\)m Siliciumdioxid und \(1,51\,\upmu\)m Polystyrolkugeln (in Orange bzw. Cyan) und die \(2,63\,\upmu\)m Silica- und \(2,56\,\upmu\)m Polystyrolkugeln (in Gelb bzw. Violett).

Diese Technologie wurde ebenfalls verwendet, um Bakterien von Plastikkügelchen und Öl in Wasser zu unterscheiden,51 da jede dieser Arten aus Materialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes besteht. Eine Untersuchung poröser Silica-Partikel zeigte, dass THC in der Lage ist, subtile Veränderungen in der Partikelzusammensetzung zu erkennen52,53. Die Fähigkeit, kleine Änderungen in der Partikelzusammensetzung zu erkennen, beruht auf dem Effektivkugelmodell und der Theorie des effektiven Mediums52,54. THC charakterisiert jedes Partikel, das durch den Sichtbereich des Mikrofluidikchips fließt, und analysiert es unter der Annahme, dass es sich um eine Kugel handelt. THC findet eine wirksame Kugel mit einem Hologramm, das dem Hologramm des analysierten Partikels am ähnlichsten ist. Wenn die Zusammensetzung eines einzelnen Partikels heterogen ist, sodass verschiedene Komponenten eines Partikels unterschiedliche Brechungsindizes aufweisen, erzeugt der THC-Anpassungsalgorithmus einen Brechungsindex für dieses Partikel, der dem Durchschnitt der Brechungsindizes seiner verschiedenen Komponenten entspricht. Im Beispiel eines porösen Silica-Partikels in Wasser liegt der Brechungsindex eines bestimmten Partikels irgendwo zwischen dem Brechungsindex der Silica-Matrix und dem Brechungsindex des Wassers, das seine Poren füllt. Inwieweit der resultierende effektive Brechungsindex näher an Siliciumdioxid oder an Wasser liegt, hängt von der Porosität des Partikels ab. Daher ist es möglich, morphologische Informationen aus dem Verhalten des Partikelbrechungsindex in Medien mit unterschiedlichen Brechungsindizes zu extrahieren. Quantitative morphologische Informationen über die Partikelporosität wurden in porösen Kunststoffen, Proteinaggregaten und Nanopartikelagglomeraten untersucht52,55. Darüber hinaus wurden verschiedene Partikelformen mit THC abgebildet und modelliert, darunter kolloidale Fraktale56, poröse Kugeln52,53, stabförmige E. coli51, Mikrosphären-Dimere57 und transparente Scheiben58. Während in unserem Ansatz die Streuung jedes Partikels an ein Kugelmodell angepasst wird, eignen sich nicht-sphärische Partikel unterschiedlicher Form für die Analyse mit THC.

Hefezellen sind ebenfalls heterogene Partikel mit verschiedenen Zellbestandteilen, die als Streumaterialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes fungieren. Da der Zelltod oft mit physiologischen Veränderungen in der Zellstruktur und -zusammensetzung einhergeht, ist zu erwarten, dass diese Veränderungen den Brechungsindex und die Form der Zellen verändern und daher durch eine Analyse mit THC nachgewiesen werden sollten.

Ein typisches Streudiagramm der THC-Ergebnisse einer Hefeprobe vor der Zugabe von Alkohol ist in Abb. 2a dargestellt. Die orangefarbenen und cyanfarbenen Kästchen sind benutzerdefinierte Bereiche, die toten bzw. lebenden Hefezellen entsprechen. Die Punkte sind entsprechend der Region, in die sie fallen, farbig. Die orangefarbenen Punkte entsprechen Partikeln, die als tote Zellen identifiziert wurden, die cyanfarbenen Punkte entsprechen Partikeln, die als lebende Zellen identifiziert wurden, und die grauen Punkte entsprechen anderen Partikeln, die als Trümmer identifiziert wurden (siehe Diskussion unten). In der in Abb. 2a dargestellten Probe werden 51,4 % aller erkannten Partikel als lebende Zellen, 29,7 % als tote Zellen und 18,9 % als Zelltrümmer identifiziert.

(a) Ein Streudiagramm der Größe auf der horizontalen Achse und des Brechungsindex auf der vertikalen Achse für eine Hefeprobe vor der Zugabe von Alkohol. Jeder Punkt im Diagramm stellt ein einzelnes Partikel dar, das während der THC-Analyse durch den Sichtbereich des Mikrofluidikchips floss. Die farbigen Kästchen sind benutzerdefinierte Bereiche von Interesse. Die orangefarbenen Punkte stellen tote Hefezellen dar und die cyanfarbenen Punkte stellen lebende Hefezellen dar. Partikel außerhalb der benutzerdefinierten Felder werden grau gefärbt. (b) Dichteverteilungen der Partikelgröße für die in (a) gezeigte Probe. Die orangefarbenen, cyanfarbenen und grauen Kurven stellen die Größendichteverteilungen toter Zellen, lebender Zellen bzw. aller Partikel dar. Die Fläche unter jeder Kurve für einen bestimmten Größenbereich stellt die Anzahl der Partikel (der durch diese Kurve dargestellten Arten) in diesem Größenbereich dar. Der Spitzenwert jeder Kurve zeigt die häufigste Größe jedes Partikeltyps. (c) Dichteverteilungen des Partikelbrechungsindex für die in (a) gezeigte Probe. Die Färbung ist die gleiche wie in (b). Die Fläche unter jeder Kurve für einen bestimmten Brechungsindexbereich stellt die Anzahl der Partikel (der durch diese Kurve dargestellten Arten) in diesem Brechungsindexbereich dar. Der Peak jeder Kurve zeigt den häufigsten Brechungsindex jedes Partikeltyps. (d)–(f) Streudiagramm, Diagramm der Größendichte und Diagramm der Brechungsindexdichte wie in (a)–(c), jedoch für eine Hefeprobe, die 71 Minuten lang 15 Vol.-% Isopropanol ausgesetzt wurde.

Wie in Abb. 2a zu sehen ist, überlappen sich die Größe der lebenden und toten Zellen zwar, ihre Brechungsindizes sind jedoch unterschiedlich. In dieser Probe wurden lebende Zellen im Größenbereich von \(3,5\,\upmu\)m bis \(6,2\,\upmu\)m und Brechungsindizes zwischen 1,39 und 1,416 gefunden. Abgestorbene Zellen traten in etwas kleineren Größen auf: 2,5–5,2\(\upmu\)m und deutlich größeren Brechungsindizes: zwischen 1,417 und 1,462. Die Überlappung in der Größe und der Unterschied im Brechungsindex lebender und toter Zellen wird in Abb. 2b, c weiter veranschaulicht. Bei diesen Diagrammen handelt es sich jeweils um Größen- und Brechungsindexdichteverteilungen. Die Größendichtekurve in Abb. 2b beispielsweise bezieht sich auf die Wahrscheinlichkeit, dass ein Partikel eine bestimmte Größe hat. Die Fläche unter der Kurve über einen beliebigen Partikelgrößenbereich stellt die Anzahl der Partikel dar, die in diesem Größenbereich gefunden werden können. Diese Kurven sind informativere und zuverlässigere Alternativen zu Histogrammen. In diesen Diagrammen stellen die grauen Kurven alle Partikel dar, die orangefarbenen Kurven stellen tote Zellen dar und die cyanfarbenen Kurven stellen lebende Zellen dar. In Abb. 2b zeigt die Überlappung der orangefarbenen und cyanfarbenen Kurven, dass viele lebende und tote Zellen die gleiche Größe haben. Die Überlappung der Größenverteilungen zeigt, dass die Bestimmung der Lebensfähigkeit allein anhand der Zellgröße nicht zuverlässig ist. Basierend auf Abb. 2c zeigen die orangefarbene Brechungsindex-Dichtekurve und die cyanfarbene Brechungsindex-Dichtekurve eine minimale Überlappung, was darauf hindeutet, dass lebende und tote Hefezellen durch den Brechungsindex unterscheidbar sind. In Abb. 2c liegt der Spitzenwert der Cyan-Kurve bei etwa 1,4, was darauf hinweist, dass der häufigste Brechungsindex lebender Zellen bei etwa 1,4 liegt, während der Spitzenwert der orangefarbenen Kurve bei etwa 1,435 liegt, was darauf hinweist, dass der häufigste Brechungsindex toter Zellen bei etwa 1,435 liegt.

Abbildung 2d–f zeigt Ergebnisse derselben Hefeprobe, jedoch 71 Minuten nach der Zugabe von Isopropanol bei 15 Vol.-%. Wie in Abb. 2d zu sehen ist, sind die meisten Punkte orange, was darauf hindeutet, dass die meisten Zellen bei dieser Alkoholexposition abgestorben sind. In dieser Probe werden nur 2,9 % aller erkannten Partikel als lebende Zellen, 82,4 % als tote Zellen und 14,7 % als Zelltrümmer identifiziert. Dieses Ergebnis wird in Abb. 2e, f dargestellt, in der sich die grauen Kurven und die orangefarbenen Kurven überlappen, was darauf hindeutet, dass die Mehrheit der identifizierten Partikel toten Zellen entspricht. Während die Cyan-Kurve in Abb. 2c vorhanden und dominant ist, fehlt sie in Abb. 2f fast vollständig, was den Mangel an lebenden Zellen in einer 15%igen Isopropanollösung nach 71 Minuten bestätigt.

Um zu untersuchen, wie Hefe im Laufe der Zeit auf unterschiedliche Konzentrationen von Isopropanol reagiert, und um unseren holographischen Ansatz mit dem TB-Ausschlusstest zu vergleichen, haben wir Hefeproben 0, 15 und 20 Volumenprozent Isoproponal ausgesetzt und die resultierende Lebensfähigkeit über die Zeit mit beiden gemessen xSight und Trypanblau. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse dieser Studien.

Die horizontale Achse stellt die Zeit nach der Zugabe von Alkohol dar. Die vertikale Achse stellte den Prozentsatz lebender Zellen dar, normalisiert durch den anfänglichen Zeitpunkt vor der Zugabe von Alkohol. Alle durchgezogenen Kurven sind Messungen mit THC und alle gestrichelten Kurven sind Färbemessungen mit Trypanblau. Die blauen Kurven stellen Ergebnisse der Kontrollproben ohne Alkohol dar. Die gelben Kurven stellen Ergebnisse von Proben mit 15 Vol.-% Isopropanol dar. Die orangefarbenen Kurven stellen Ergebnisse der Proben mit 20 Vol.-% Isopropanol dar.

Im Diagramm in Abb. 3 ist die horizontale Achse die Zeit nach der Zugabe von Alkohol zur Hefemischung und die vertikale Achse der Prozentsatz lebender Zellen, normalisiert durch den lebenden Prozentsatz vor der Zugabe des Alkohols. In Abb. 3 stellen die durchgezogenen Kurven Messungen mit THC dar und die gestrichelten Kurven sind Messungen, die mit dem TB-Ausschlusstest durchgeführt wurden. Die blauen Kurven entsprechen der normalisierten Lebensfähigkeit von Hefeproben ohne Alkohol. Während in diesen Kurven eine gewisse Schwankung zu beobachten ist, sind alle Kurven einander ähnlich und zeigen keinen Verlust der Lebensfähigkeit im Verlauf von 80 Minuten. Die gelben Kurven stellen Ergebnisse für Proben mit zugesetztem Alkohol von 15 Vol.-% dar. Eine ähnliche Abnahme der normalisierten Lebensfähigkeit im Zeitverlauf ist in allen gelben Kurven zu erkennen. Die orangefarbenen Kurven stellen Ergebnisse für Proben mit zugesetztem 20-Vol.-%-Alkohol dar und zeigen einen schnelleren Abfall der Lebensfähigkeit als Funktion der Zeit. Unter allen Bedingungen ähneln die gestrichelten Kurven den durchgezogenen Kurven, was auf eine starke Übereinstimmung bei den normalisierten Lebensfähigkeitsänderungen zwischen THC und dem TB-Ausschlusstest schließen lässt.

Beachten Sie, dass die normalisierten Lebensfähigkeitsergebnisse zwar zwischen den THC-Ergebnissen und den TB-Färbungsergebnissen übereinstimmen, die absoluten Lebensfähigkeiten jedoch variieren können. Tatsächlich stellen wir fest, dass die absolute Lebensfähigkeit bei Verwendung von TB im Vergleich zu holographischen Ergebnissen durchgängig überschätzt wird. Sechs aufeinanderfolgende Messungen einer Hefeprobe mit THC ergaben eine durchschnittliche Lebensfähigkeit von \(52,3 \pm 0,9 \%\). Die gleiche Probe, gemessen mit TB-Färbung, ergab eine durchschnittliche Lebensfähigkeit von \(56 \pm 3 \%\). Zusätzlich zu einer höheren Lebensfähigkeitsmessung, die mit einer Unterzählung abgestorbener Zellen vereinbar ist, zeigte die TB-Färbung auch eine höhere Variabilität zwischen den Messungen. Diese Beobachtung steht im Einklang mit anderen Studien, die über solche Einschränkungen beim TB-Färbungsansatz berichteten16.

Die Färbung von Saccharomyces cerevisiae mit Tuberkulose zeigte vor der Behandlung mit Alkohol eine gemischte Population lebender und toter Zellen. Wie in Abb. 4a dargestellt, ist in einem einzelnen Raster eine Kombination aus lebenden Zellen (ungefärbt und blau markiert) sowie toten Zellen (gefärbt und orange markiert) sichtbar. Während die Lebensfähigkeitskategorisierung in Abb. 4a klar ist, ist sie in Abb. 4b weniger klar, insbesondere in den grau eingekreisten Fällen. Zellen, die den Farbstoff teilweise absorbieren, und solche, die sich zusammenballen, stellen eine Herausforderung für färbungsbasierte Lebensfähigkeitstests dar.

Typische Ergebnisse eines Trypanblau-Ausschlusstests. (a) Eine Gitterzelle, die eine Mischung aus lebenden und toten Hefezellen zeigt. Lebende Zellen nehmen den Farbstoff nicht auf und erscheinen hellgrau. Sie sind mit blauen Pfeilen gekennzeichnet. Abgestorbene Zellen sind für den Farbstoff durchlässig und erscheinen dunkelblau/grau. Sie sind mit orangefarbenen Pfeilen gekennzeichnet. (b) Eine Gitterzelle, die Zellen mit einem nicht eindeutigen Lebensfähigkeitsstatus basierend auf dem Trypanblau-Ausschlusstest zeigt. Diejenigen mit einem nicht schlüssigen Status sind durch graue Kreise umschrieben.

Das Vorhandensein von mehrdeutig gefärbten Zellen, wie in Abb. 4b, kann ebenfalls zu der oben erwähnten höheren Variabilität bei den Färbungsmessungen beitragen als bei Messungen mit THC.

Neben der Messung der Partikelgröße und des Brechungsindex analysiert THC auch die Partikelmorphologie. Genauer gesagt ist die Symmetrie des Hologramms, das einem bestimmten Partikel entspricht, ein Hinweis auf die Symmetrie des Partikels selbst. Von einem perfekt kugelförmigen Partikel wird erwartet, dass es ein nahezu perfekt symmetrisches Hologramm aufweist, während Partikel, die von der Kugel abweichen, Abweichungen von der Symmetrie in ihren Hologrammen aufweisen. Diese Abweichungen von der erwarteten Symmetrie \(\Delta S\) werden mit THC analysiert und quantifiziert. Abbildung 5a unten zeigt schematisch drei Partikelformen mit zunehmender Abweichung von der Symmetrie, \(\Delta S\). In Abb. 5b zeigt die erste Spalte Beispiele für Hologramme einer 1,54 µm großen Polystyrolkugel, einer toten Hefezelle und einer lebenden Hefezelle. Die zweite Spalte von Abb. 5b zeigt die Anpassungen jedes dieser Hologramme an die Lorenz-Mie-Theorie der Lichtstreuung. Die dritte Spalte zeigt die Residuen zwischen den Hologrammen und ihre jeweiligen Anpassungen. Die \(\Delta S\)-Metrik wird wiederum basierend auf den Residuen aus den Anpassungen berechnet. Höhere Residuen entsprechen einer größeren Abweichung von der Symmetrie und tragen zu höheren \(\Delta S\)-Werten bei.

(a) Schematische Darstellung von Partikeln mit zunehmender Abweichung von der Symmetrie von oben nach unten. Der orange gepunktete Kreis stellt die geschätzte Kugel dar, die dem gegebenen Teilchen am nächsten kommt. (b) Hologramme, passend zur Lorenz-Mie-Theorie, und Reste (jeweils von links nach rechts) einer Polystyrolkugel, einer toten Hefezelle und einer lebenden Hefezelle (jeweils von oben nach unten). (c) Wahrscheinlichkeitsdichteverteilungen der Abweichung von der Symmetrie, \(\Delta S\), von \(1,54\,\upmu\)m Polystyrolkugeln (in Gelb), toten Hefezellen (in Orange) und lebenden Hefezellen ( in Cyan). (d) Ein Histogramm der Unterschiede zwischen den Mittelwerten von \(\Delta S\) lebender und toter Hefezellen für 45 Probenmessungen.

Die Morphologieanalyse lebender und toter Hefezellen mit THC zeigt, dass tote Zellen kugelförmiger sind als lebende Zellen. Abbildung 5c ​​zeigt drei Wahrscheinlichkeitsdichteverteilungen von \(\Delta S\): die von Polystyrol-Mikrokügelchen in Gelb, die von toten Hefezellen in Orange und die von lebenden Hefezellen in Cyan. Die Symmetrieabweichungen von Polystyrol-Mikrokügelchen liegen am nächsten bei \(\Delta S = 0\), was erwartungsgemäß auf einen hohen Grad an sphärischer Symmetrie hinweist. Die orangefarbene Kurve, die toten Hefezellen entspricht, enthält 2295 Zellen und ist weiter von \(\Delta S = 0\) entfernt, während die cyanfarbene Kurve, die lebenden Zellen entspricht, 1916 Zellen enthält und am weitesten von \(\Delta S = entfernt ist 0\). Die \(\Delta S\)-Mittelwerte unterscheiden sich deutlich (\(\hbox {p}<0,0001\)) zwischen den lebenden und toten Zellpopulationen. Das Ergebnis, dass \(\Delta S\) für tote Zellen kleiner ist als für lebende Zellen, weist darauf hin, dass tote Hefezellen kugelsymmetrischer sind als lebende Zellen. Abbildung 5d zeigt ein Histogramm der Unterschiede zwischen dem Mittelwert \(\Delta S\) für lebende Zellen, \(\overline{\Delta S}_{live}\) und dem Mittelwert \(\Delta S\) für tote Zellen , \(\overline{\Delta S}_{dead}\). Das Histogramm enthält Daten von 45 Hefeproben, die verschiedenen Alkoholkonzentrationen ausgesetzt waren. Da für jede Probe \(\overline{\Delta S}_{live} - \overline{\Delta S}_{dead} > 0\) war, erschienen tote Hefezellen bei jeder Messung kugelförmiger als lebende Zellen. Während dieser Befund bei Hefe bisher nicht berichtet wurde, wurden solche morphologischen Veränderungen bei Krebszellen identifiziert, die pH-Änderungen ausgesetzt waren, die zu ihrem Zelltod führten59, und die Kugelform wurde mit dem Zelltod bei E. coli in Verbindung gebracht60.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Lebensfähigkeit von Hefezellen mithilfe von THC effektiv beurteilt werden kann. Im Durchschnitt verkleinerten sich Hefezellen und ihr Brechungsindex nahm zu, wenn sie hochkonzentriertem Alkohol ausgesetzt wurden, was schließlich zum Zelltod führte. Während wir eine durchschnittliche Abnahme der Größe toter Zellen im Vergleich zu lebenden Zellen beobachten, reicht die Größe allein nicht aus, um lebende und tote Populationen zu unterscheiden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Zellbrechungsindex ein wirksamerer Unterscheidungsindikator für die Lebensfähigkeit von Zellen ist. Diese Schlussfolgerung steht auch im Einklang mit morphologischen Zellveränderungen. Wenn Zellen aufgrund des Ausstoßes von Wasser mit niedrigem Brechungsindex schrumpfen und die verbleibenden Zellunterkomponenten einen höheren Brechungsindex als Wasser aufweisen, erhöht sich der Nettobrechungsindex der Zelle, wie in unseren Messungen beobachtet. THC charakterisiert jedes Partikel, das durch den xSight-Mikrofluidikchip fließt, und analysiert es als Kugel. Die Multiparameter-Optimierung findet eine effektive Kugel mit einem Hologramm, das dem Hologramm des analysierten Partikels am ähnlichsten ist52,54. Eine kleinere Zelle mit stärker streuenden Komponenten wird als kleineres Partikel mit erhöhtem Brechungsindex identifiziert. Dieses Szenario stimmt mit unseren Ergebnissen überein. Ähnliche Veränderungen der optischen Eigenschaften von Zellen als Reaktion auf äußeren Stress, wie z. B. osmotischen Druck, wurden in anderen Studien berichtet22,31.

Neben der Beurteilung der Lebensfähigkeit ist unser holographischer Ansatz auch eine vielversprechende Möglichkeit, den Fortschritt in Richtung Zelltod oder andere Stressreaktionen zu untersuchen. Da sich viele morphologische Veränderungen als Veränderungen der Zellgröße und des Brechungsindex manifestieren können, kann THC ein leistungsstarkes Werkzeug sein, um diese Veränderungen in Echtzeit quantitativ zu verfolgen. Beispielsweise wurde in einer Reihe von Studien der Einsatz der Holographie zur Bestimmung der Toxizität verschiedener Verbindungen durch Beobachtung biophysikalischer Veränderungen in Säugetierzellen untersucht29,30,33,34,35. Unser Ansatz mit THC ist ein spannendes ergänzendes Werkzeug zu bestehenden Technologien. Es kann eine schnelle Beurteilung der Veränderungen der Größe und des Brechungsindex lebender Zellen in ihrer natürlichen Umgebung als Reaktion auf die interessierenden Toxine ermöglichen.

Zusätzlich zur Identifizierung lebender und toter Zellen identifizierte unsere Technologie eine dritte Population von Partikeln, die in Abb. 2a, d grau markiert sind. Diese Partikel waren größtenteils kleiner oder hatten einen niedrigeren Index als das, was wir als Hefezellen identifizierten. Möglicherweise handelt es sich dabei um Zellfragmente. Es könnte sich auch um Aggregate von Materialien handeln, die von der Hefe in Lösung produziert werden, oder um Verunreinigungen aus anderen Quellen. Die Kombination aus Größe und Brechungsindex vieler dieser Partikel stimmt mit dem überein, was für Proteinaggregate mit THC55,61,62 beobachtet wurde. Um diese Partikel endgültig zu identifizieren, sind weitere Untersuchungen erforderlich.

In dieser Arbeit haben wir die Reaktion von Saccharomyces cerevisiae auf verschiedene Konzentrationen von Isporpopanol untersucht. Andere Studien haben die Lebensfähigkeit der Zellen als Reaktion auf Stress wie andere Alkohole, osmotischen Druck und Hitze untersucht36,37,63,64. Auch unter diesen Bedingungen ist THC ein vielversprechender Ansatz zur Untersuchung der Lebensfähigkeit. Es bietet einen ergänzenden Ansatz für andere Entwicklungstechnologien, die andere Streutechniken nutzen. Holographische Veränderungen in Zellen beim Tod sollten in ähnlicher Weise bei anderen Zelltypen wie Bakterien und tierischen Zellen beobachtet werden. THC sollte ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung eines breiten Spektrums biologischer Systeme sein.

Unsere Ergebnisse stellen einen leistungsstarken Ansatz zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Hefen mithilfe der holographischen Videomikroskopie dar. Der Zelltod als Reaktion auf Alkoholexposition ging mit einem Anstieg des Zellbrechungsindex in der Bevölkerung einher, was darauf hindeutet, dass dieser optische Parameter bei der Identifizierung lebender und toter Zellen wirksam ist. Der vorgeschlagene holographische Ansatz ist schnell, automatisiert und markierungsfrei und beseitigt viele der Einschränkungen herkömmlicher färbungsbasierter Lebensfähigkeitstests. Die Methodik ist objektiv und erfordert keine Benutzeridentifizierung jeder Zelle, sobald die Brechungsindexbereiche identifiziert wurden. Daher kann THC auf die automatisierte Lebensfähigkeitsanalyse mit hohem Durchsatz in einer Vielzahl industrieller Anwendungen ausgeweitet werden.

Die Hefelösung wurde unter Verwendung von Glucose (Marke SIGMA, Artikel G8270-1KG), gefiltertem entionisiertem (DI) Wasser und trockener Instanthefe (Marke Amish Market, New York, NY) hergestellt. Eine Glucose-Stammmischung wurde durch Mischen von 25 g entionisiertem Wasser mit 0,5 g Glucose hergestellt, bis die Glucose vollständig aufgelöst war. Nach dem Auflösen wurde die Glukosemischung mit einem 60-ml-Luer-Lock-Einwegspritzenfilter (0,45 µm) (Marke Millex) filtriert. Wenn die Glukosemischung nicht für den sofortigen Gebrauch bestimmt war, wurde sie in einem Kühlschrank bei \(4\,^{\circ }\)C aufbewahrt.

Die Glukoselösung wurde mit gefiltertem entionisiertem Wasser im Verhältnis 1:1 verdünnt, wobei jeweils 4 ml in einem 30-ml-Fläschchen verwendet wurden. Unter Verwendung trockener Instanthefe wurden 4–7 Pellets in die verdünnte Glukosemischung gegeben und das Fläschchen wurde von Hand geschüttelt und gevortext, bis sich alle Hefepellets aufgelöst hatten. Die Hefelösungen wurden bei \(40\,^{\circ }\)C inkubiert (Benchmark, Roto-Therm mini). Sobald der Inkubator die richtige Temperatur erreicht hatte, wurde die Hefemischung für 30 Minuten in den Inkubator gestellt. Nach 30 Minuten wurde die Mischung aus dem Inkubator genommen und kurz geschüttelt, um eventuelle Hefereste aufzulösen. Für jeden Versuchstag wurde eine frische Hefemischung hergestellt.

Drei Alkoholkonzentrationen wurden getestet: 0 % Isopropanol (Kontrolle), 15 Vol.-% Isopropanol in Glucoselösung und 20 Vol.-% Isopropanol in Glucoselösung. Jede Alkoholkonzentration wurde hergestellt, indem die Lösung in ein 10-ml-Fläschchen gegeben und das Endvolumen auf insgesamt 2 ml gebracht wurde. Für die Kontrolle und für 15 %ige Isopropanollösung wurden die Proben über etwa 90 Minuten gemessen. Für die 20 %ige Isopropanollösung wurden die Proben über einen Zeitraum von etwa 45 Minuten gemessen. Zur Kontrolle wurde die Stoppuhr gestartet, nachdem die Lösung verwirbelt wurde. Für die 15- und 20-prozentigen Alkohollösungen wurde die Stoppuhr gestartet (\(t=0\)), sobald der Alkohol in das 10-ml-Fläschchen mit der Hefelösung gegeben wurde. Für jede Bedingung wurde die Lebensfähigkeit einmal vor der Einführung des Alkohols und dann nacheinander nach der Zugabe von Alkohol gemessen.

Holographische Videomikroskopie21,40,62 Messungen wurden mit xSight (Spheryx, Inc.), der THC-Implementierung von Spheryx, durchgeführt. Für jede Messung wurde ein Probenvolumen von \(30\,\upmu\)L in eines der acht Reservoirs auf einem xCell, einem mikrofluidischen Einweg-Probenchip (Spheryx, Inc.), gegeben. Der Fluss der Probe durch den Mikrofluidikkanal wurde in xSight automatisch durch Anwendung einer Vakuumdichtung und einer Pumpe hergestellt, wodurch ein gleichmäßiger Poiseuille-Fluss erzeugt wurde21,57. Ein kollimierter Laserstrahl mit einer Vakuumwellenlänge von 638 nm beleuchtete den Sichtbereich der xCell, während die Probe floss. Von Partikeln in der Probe gestreutes Licht interferierte mit einfallendem Licht und erzeugte Hologramme, die zur weiteren Analyse auf einer Kamera aufgezeichnet wurden. Jedes Hologramm wurde mit THC analysiert, was zu einer Multiparameter-Anpassung für die Größe, den Brechungsindex und die dreidimensionale Position jedes Partikels führte.

Für jede Probe wurden die Probenviskosität und der Brechungsindex des Mediums (Wasser mit Glucose) gemessen und in xSight eingegeben. Der Brechungsindex des Mediums wurde mit einem Handrefraktometer (Antago, Taschenrefraktometer) gemessen. Durch Drücken der START-Taste wurde die Messung gestartet. Die Messung erfolgt automatisch und dauert für jede Probe ca. 15 Minuten.

Die erste Messung der Hefelösung vor der Zugabe von Alkohol wurde als Zeitpunkt „\(t=-1\)“ gekennzeichnet und zur Normalisierung des Rests der Lebensfähigkeitskurve verwendet. Alle anderen Zeitpunkte wurden so aufgezeichnet, als ob die START-Taste gedrückt wurde. Das für jede Probe gemessene Volumen betrug \(1\,\upmu\)L.

Die Kästchen, die die lebenden und toten Hefepopulationen umschrieben, waren benutzerdefinierte Regionen von Interesse, die durch die xSight-Software aktiviert wurden. Sobald die interessierenden Regionen definiert waren, wurden die Ergebnisse der Analysen lebender und toter Zellen automatisch berechnet, wodurch die Konzentration, die mittlere Größe und der mittlere Brechungsindex jeder Population ermittelt wurden. Die Regionen wurden bestimmt, um die unterschiedlichen Populationen abzugrenzen. Die Lebensfähigkeit jeder Probe wurde dann anhand der automatisch berechneten Statistiken jeder Region aufgezeichnet.

Die Färbungsmessungen wurden in Mikrozentrifugenröhrchen (uLab Scientific) durchgeführt. \(30\,\upmu\)L Hefeprobe und \(30\,\upmu\)L Farbstoff wurden in das Röhrchen gemischt und 2 Minuten lang stehen gelassen. Nach 2 Minuten wurden \(30\,\upmu\)L der gefärbten Probe auf ein verbessertes Neubauer-Hämozytometer (Fristaden Labs) gegeben. Ein Deckglas wurde auf das Hämozytometer gelegt und unter einem Mikroskop (AmScope) mit 10-facher Vergrößerung betrachtet. Auf dem Hämozytometer wurden die Zellen auf acht der 4x4-Gitterkästen für die Analyse der Färbelebensfähigkeit gezählt. Nachdem die Zählung abgeschlossen war, wurde das Hämozytometer mit Isopropanol und entionisiertem Wasser gereinigt und mit einem Kimwipe abgetupft. Das Hämozytometer konnte vollständig an der Luft trocknen, bevor die nächste Messung durchgeführt wurde. Wie bei THC wurde der Zeitpunkt der ersten Messung vor der Zugabe von Alkohol mit „\(t=-1\)“ gekennzeichnet. Der Beginn des Färbeversuchs (\(t=0\)) wurde markiert, als der Farbstoff in die Probe eingebracht wurde.

Parapouli, M., Vasileiadis, A., Afendra, A.-S. & Hatziloukas, E. Saccharomyces cerevisiae und seine industriellen Anwendungen. ZIELE Mikrobiol. 6, 1–32. https://doi.org/10.3934/microbiol.2020001 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Botstein, D. & Fink, GR Hefe: Ein experimenteller Organismus für die Biologie des 21. Jahrhunderts. Genetik 189, 695–704. https://doi.org/10.1534/genetics.111.130765 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duina, AA, Keeney, JB & Miller, ME Angehende Hefe für angehende Genetiker: Eine Einführung in das Saccharomyces cerevisiae-Modellsystem. Genetik 197, 33–48. https://doi.org/10.1534/genetics.114.163188 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guaragnella, N. et al. Die wachsende Rolle von Hefen in der Krebsforschung und -diagnose: Einblicke in die Funktion der Onkosuppressoren p53 und brca1/2. FEMS Heferes. 14, 2–16. https://doi.org/10.1111/1567-1364.12094 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bete, L. LH Hartwells Hefe: Ein Modellorganismus zur Untersuchung somatischer Mutationen und Krebs. Nat. Educ. 1, 183 (2008).

Google Scholar

Ferreira, R., Limeta, A. & Nielsen, J. Krebsbekämpfung mit hefebasierten Technologien. Trends Biotechnologie. 37, 66. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.11.013 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Gomes, A., Carmo, T., Carvalho, L., Bahia, F. & Skorupa Parachin, N. Vergleich von Hefen als Wirte für die rekombinante Proteinproduktion. Mikroorganismen 6, 38. https://doi.org/10.3390/microorganisms6020038 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Huang, M., Bao, J., Hallstrom, BM, Petranovic, D. & Nielsen, J. Eine effiziente Proteinproduktion durch Hefe erfordert eine globale Abstimmung des Stoffwechsels. Nat. Commun.https://doi.org/10.1038/s41467-017-00999-2 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hyunah, K., Yoo, S. & Kang, HA Hefesynthetische Biologie zur Herstellung rekombinanter therapeutischer Proteine. FEMS Heferes. 15, 66. https://doi.org/10.1111/1567-1364.12195 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Lodolo, EJ, Kock, JL, Axcell, BC & Brooks, M. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae – die Hauptfigur beim Bierbrauen. FEMS Heferes. 8, 1018–1036. https://doi.org/10.1111/j.1567-1364.2008.00433.x (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Briggs, DE, Boulton, CA, Brookes, PA & Stevens, R. Brewing: Wissenschaft und Praxis (Woodhead Publishing, 2004).

Maicas, S. Die Rolle von Hefen in Fermentationsprozessen. Mikroorganismen 8, 1142. https://doi.org/10.3390/microorganisms8081142 (2020).

Artikel CAS PubMed Central Google Scholar

Fleet, G. Hefen in Lebensmitteln und Getränken: Auswirkungen auf Produktqualität und -sicherheit. Curr. Meinung. Biotechnologie. 18, 170–5. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2007.01.010 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kwolek-Mirek, M. & Zadrag-Tecza, R. Vergleich der Methoden zur Beurteilung der Lebensfähigkeit und Vitalität von Hefezellen. FEMS Heferes. 14, 1068–1079. https://doi.org/10.1111/1567-1364.12202 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Strober, W. Trypanblau-Ausschlusstest der Zelllebensfähigkeit. Curr. Protokoll. Immunol.https://doi.org/10.1002/0471142735.ima03bs111 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan, LL, Kuksin, D., Laverty, DJ, Saldi, S. & Jean, Q. Morphologische Beobachtung und Analyse mittels automatisierter Bildzytometrie zum Vergleich von Trypanblau und der fluoreszenzbasierten Lebensfähigkeitserkennungsmethode. Zytotechnologie 67, 461–473. https://doi.org/10.1007/s10616-014-9704-5 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mascotti, K., McCullough, J. & Burger, SR HPc-Lebensfähigkeitsmessung: Trypanblau im Vergleich zu Acridinorange und Propidiumiodid. Transfus 40, 693–696. https://doi.org/10.1046/j.1537-2995.2000.40060693.x (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Tennant, J. Bewertung der Trypanblau-Technik zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen. Transplantation 2, 686–694 (1964).

Artikel Google Scholar

Chan, LL, Rice, W. & Qiu, J. Beobachtung und Quantifizierung der morphologischen Wirkung von Trypanblau auf das Aufbrechen toter oder sterbender Zellen. PLoS ONE 15, 66. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227950 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Mernier, G., Piacentini, N., Tornay, R., Buffi, N. & Renaud, P. Bewertung der Zelllebensfähigkeit mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von Hefe als Zellmodell. Sens. Aktoren B Chem. 154, 160–163. https://doi.org/10.1016/j.snb.2009.11.066 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Cheong, FC et al. Strömungsvisualisierung und Durchflusszytometrie mit holographischer Videomikroskopie. Opt. Express 17, 13071–13079. https://doi.org/10.1364/OE.17.013071 (2009).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Midtvedt, D., Olsen, E., Hook, F. & Jeffries, GD Markierungsfreie räumlich-zeitliche Überwachung der zytosolischen Masse, Osmolarität und des Volumens in lebenden Zellen. Nat. Komm. 10, 66. https://doi.org/10.1038/s41467-018-08207-5 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Gorbenko, D. et al. Quantifizierung von Veränderungen der Zellmorphologie während der Zellnekrose anhand von 3D-Brechungsindexverteilungen. J. Phys.: Conf. Ser. 1236, 012015. https://doi.org/10.1088/1742-6596/1236/1/012015 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Rommel, CE et al. Kontrastverstärkte digitale holographische Abbildung zellulärer Strukturen durch Manipulation des intrazellulären Brechungsindex. J. Biomed. Opt. 15, 1–10. https://doi.org/10.1117/1.3449567 (2010).

Artikel Google Scholar

Cheong, FC et al. Schnelle Hochdurchsatzverfolgung der Bakterienmotilität in 3D mittels holographischer Phasenkontrast-Videomikroskopie. Biophys. J. 108, 1248–1256. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.01.018 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feizi, A. et al. Schnelle, tragbare und kostengünstige Analyse der Lebensfähigkeit und Konzentration von Hefezellen mithilfe linsenloser On-Chip-Mikroskopie und maschinellem Lernen. Laborchiphttps://doi.org/10.1039/C6LC00976J (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Rappaz, B., Breton, B., Shaffer, E. & Turcatti, G. Digitale holographische Mikroskopie: Eine quantitative, markierungsfreie Mikroskopietechnik für das phänotypische Screening. Kombin. Chem. Hochdurchsatzsieb. 14, 66. https://doi.org/10.2174/13862073113166660062 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Bélanger, E., Lévesque, SA, Rioux-Pellerin, A., Lavergne, P. & Marquet, P. Messung des absoluten Zellvolumens mithilfe quantitativer digitaler holographischer Phasenmikroskopie und einer kostengünstigen, Open-Source- und 3D-gedruckten Methode Strömungskammer. Vorderseite. Physik. 7, 172. https://doi.org/10.3389/fphy.2019.00172 (2019).

Artikel Google Scholar

Ugele, M. et al. Markierungsfreier Hochdurchsatznachweis von p. Falciparum-Infektion in kugelförmigen Erythrozyten mit digitaler holographischer Mikroskopie. Lab Chip 18, 66. https://doi.org/10.1039/C8LC00350E (2018).

Artikel Google Scholar

Mugnano, M. et al. In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung von Cadmium durch markierungsfreie holographische Mikroskopie. J. Biophoton. 11, e201800099. https://doi.org/10.1002/jbio.201800099 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Kastl, L., Isbach, M., Dirksen, D., Schnekenburger, J. & Kemper, B. Quantitative Phasenbildgebung für die Zellkultur-Qualitätskontrolle: Markierungsfreie Zellkultur-Qualitätskontrolle. Zytom. A 91, 66. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23082 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Min, J. et al. Quantitative Phasenbildgebung von Zellen in einer Durchflusszytometrie-Anordnung unter Verwendung der auf Michelson-Interferometern basierenden außeraxialen digitalen holographischen Mikroskopie. J. Biophoton. 12, 66. https://doi.org/10.1002/jbio.201900085 (2019).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Eder, KM et al. Markierungsfreie digitale holographische Mikroskopie zur In-vitro-Quantifizierung der zytotoxischen Wirkung organischer Nanopartikel. Zellen 11, 66. https://doi.org/10.3390/cells11040644 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Kühn, J. et al. Markierungsfreier Zytotoxizitäts-Screening-Assay mittels digitaler holographischer Mikroskopie. Assay Drug Dev. Technol. 11, 101–107. https://doi.org/10.1089/adt.2012.476 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Makdasi, E. et al. Ganzzell-Multiparameter-Assay für die auf Ricin- und Abrin-Aktivität basierende digitale holographische Mikroskopie. Toxinehttps://doi.org/10.3390/toxins11030174 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pratt, PL, Bryce, JH & Stewart, GG Die Auswirkungen von osmotischem Druck und Ethanol auf die Lebensfähigkeit und Morphologie von Hefen. J. Inst. Brauen. 109, 218–228 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Odumeru, JA, D'Amore, T., Russel, I. & Stewart, GG Auswirkungen von Hitzeschock und Ethanolstress auf die Lebensfähigkeit eines Brauhefestamms von Saccharomyces uvarum (carlsbergensis) während der Fermentation von Würze mit hoher Schwerkraft. J. Ind. Microbiol. 10, 111–116 (1992).

Artikel Google Scholar

Gabor, D. Ein neues mikroskopisches Prinzip. Natur 161, 777–778. https://doi.org/10.1038/161777a0 (1948).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Sheng, J., Malkiel, E. & Katz, J. Digitales holographisches Mikroskop zur Messung dreidimensionaler Partikelverteilungen und -bewegungen. Appl. Opt. 45, 3893–3901. https://doi.org/10.1364/AO.45.003893 (2006).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Lee, S.-H. et al. Charakterisierung und Verfolgung einzelner kolloidaler Partikel mit videoholographischer Mikroskopie. Opt. Express 15, 18275–18282. https://doi.org/10.1364/OE.15.018275 (2007).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Cheong, FC, Krishnatreya, BJ & Grier, DG Strategien zur dreidimensionalen Partikelverfolgung mit holographischer Videomikroskopie. Opt. Express 18, 13563–13573. https://doi.org/10.1364/OE.18.013563 (2010).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Perry, R., Meng, G., Dimiduk, T., Fung, J. & Manoharan, V. Realraumstudien der Struktur und Dynamik selbstorganisierter kolloidaler Cluster. Faraday-Diskussion. 159, 66. https://doi.org/10.1039/c2fd20061a (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, A. et al. Verwendung der diskreten Dipolnäherung und der holographischen Mikroskopie zur Messung der Rotationsdynamik nicht-sphärischer Kolloide. J. Quant. Spectrosc. Strahlen. Transf.https://doi.org/10.1016/j.jqsrt.2013.12.019 (2013).

Artikel Google Scholar

Schnars, U. & Jüptner, W. Direkte Aufzeichnung von Hologrammen durch ein CCD-Target und numerische Rekonstruktion. Appl. Opt. 33, 179–81 (1994).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Cuche, E., Marquet, P. & Depeursinge, C. Gleichzeitige Amplitudenkontrast- und quantitative Phasenkontrastmikroskopie durch numerische Rekonstruktion von Fresnel-Off-Axis-Hologrammen. Appl. Opt. 38, 6994–7001. https://doi.org/10.1364/AO.38.006994 (2000).

Artikel ADS Google Scholar

Ovryn, B. & Izen, S. Abbildung transparenter Kugeln durch eine planare Grenzfläche unter Verwendung eines optischen Mikroskops mit hoher numerischer Apertur. J. Opt. Soc. Bin. Eine Opt. Bildwissenschaft. Vision 17, 1202–13. https://doi.org/10.1364/JOSAA.17.001202 (2000).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Xu, W., Jericho, M., Meinertzhagen, I. & Kreuzer, H. Digitale Inline-Holographie von Mikrosphären. Appl. Opt. 41, 5367–75. https://doi.org/10.1364/AO.41.005367 (2002).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Bohren, CF & Huffman, DR Absorption und Streuung von Licht durch kleine Partikel (Wiley, New York, 1983).

Google Scholar

Mishchenko, MI, Travis, LD & Lacis, AA Streuung, Absorption und Emission von Licht durch kleine Partikel (Cambridge University Press, 2001).

Gouesbet, G. & Grehan, G. Verallgemeinerte Lorenz-Mie-Theorien (Springer, 2011).

Philips, L. et al. Holographische Charakterisierung von Schadstoffen in Wasser: Differenzierung suspendierter Partikel in heterogenen Dispersionen. Wasserres. 122, 66. https://doi.org/10.1016/j.watres.2017.06.006 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Odete, MA et al. Die Rolle des Mediums bei der Effektivsphäreninterpretation holographischer Partikelcharakterisierungsdaten. Weiche Materiehttps://doi.org/10.1039/c9sm01916b (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheong, FC, Xiao, K., Pine, D. & Grier, D. Holographische Charakterisierung der Porosität einzelner kolloidaler Kugeln. Weiche Materie 7, 6816–6819. https://doi.org/10.1039/C1SM05577A (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Markel, VA Einführung in die Maxwell-Garnet-Näherung: Tutorial. J. Opt. Soc. Bin. Eine Opt. Bildwissenschaft. Vis. 33, 1244–1256. https://doi.org/10.1364/JOSAA.33.001244 (2016).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Winters, A. et al. Quantitative Differenzierung von Proteinaggregaten von anderen unsichtbaren Partikeln in viskosen Mischungen durch holographische Charakterisierung. J. Pharm. Sci.https://doi.org/10.1016/j.xphs.2020.05.002 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, C. et al. Holographische Charakterisierung kolloidaler fraktaler Aggregate. Soft Matter 12(42), 8774–80. https://doi.org/10.1039/c6sm01790h (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Altman, LE, Quddus, R., Cheong, FC & Grier, DG Holographische Charakterisierung und Verfolgung kolloidaler Dimere in der Effektivsphären-Näherung. Weiche Materiehttps://doi.org/10.1039/D0SM02262D (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Ruffner, D., Cheong, FC, Blusewicz, J. & Philips, L. Aufhebung der Entartung bei der holographischen Charakterisierung kolloidaler Partikel mittels Mehrfarbenbildgebung. Opt. Express 26, 13239. https://doi.org/10.1364/OE.26.013239 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakao, S., Kojima, K. & Sudo, Y. Phototriggerierter apoptotischer Zelltod (pta) unter Verwendung der lichtgetriebenen nach außen gerichteten Protonenpumpe Rhodopsin Archaerhodopsin-3. Marmelade. Chem. Soc. 144, 3771–3775. https://doi.org/10.1021/jacs.1c12608 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Young, KD Warum kugelförmige Escherechia coli stirbt: Die Insider-Geschichte. J. Bakteriol. 190, 1497–1498. https://doi.org/10.1128/JB.01975-07 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kasimbeg, PN, Cheong, FC, Ruffner, DB, Blusewicz, JM & Philips, LA Holographische Charakterisierung von Proteinaggregaten in Gegenwart von Silikonöl und Tensiden. J. Pharm. Wissenschaft. 108, 155–161. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2018.10.002 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, C. et al. Holographische Charakterisierung von Proteinaggregaten. J. Pharm. Wissenschaft. 105, 1074–1085. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2015.12.018 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gibson, BR, Lawrence, SJ, Leclaire, JPR, Powell, CD & Smart, KA Hefereaktionen auf Belastungen im Zusammenhang mit der Handhabung in der Industriebrauerei. FEMS Mikrobiol. Rev. 31, 535–569. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2007.00076.x (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hohmann, S. & Mager, W. Hefe-Stressreaktionen (Springer, 2003).

Referenzen herunterladen

Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsergebnisse wurden teilweise vom National Center For Advancing Translational Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer R44TR001590 unterstützt. Für den Inhalt sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wieder.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Rostislav Boltyanskiy und Mary Ann Odete.

Spheryx, Inc., New York, NY, 10016, USA

Rostislav Boltyanskiy, Mary Ann Odete, Fook Chiong Cheong und Laura A. Philips

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LAP und FCC konzipierten die Experimente, RB, MAO und FCC führten die Experimente durch. Alle Autoren analysierten die Ergebnisse und überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Rostislav Boltyanskiy.

Alle Autoren sind bei Spheryx, Inc. angestellt, dem Hersteller von xSight und xCells, die für die Durchführung der in dieser Veröffentlichung beschriebenen Forschung verwendet wurden.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Boltyanskiy, R., Odete, MA, Cheong, FC et al. Markierungsfreier Lebensfähigkeitstest mittels holographischer Inline-Videomikroskopie. Sci Rep 12, 12746 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17098-y

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Eingegangen: 29. November 2021

Angenommen: 20. Juli 2022

Veröffentlicht: 26. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17098-y

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